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ELISA标准操作及技术服务的常见问题

时间：2018-05-10

一.ELISA标准操作要点
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的纯化水电导率小于1。5μs/cm。
1.标本的采取和保存
大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体性HRP，也会产生假阳性反应。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需-20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。
2.加样
加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。
3.保温
在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。
另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。
4.洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0。05%-0。2%之间，高于0。2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释，应按要求稀释，所用的水电导率最好在1。5us/cm之下，洗液如果结晶应待其融解后配制。保证洗板浸泡时间为40秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。
5.显色和比色
TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。
酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有:测读速度，读数的准确性，重复性，精确度和可测范围，线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。
测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长(W1)，第二次在不敏感波(W2)，两次测定间不移动ELISA板的位置，最终测得的A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

二.本底及假阳性产生的原因分析
1. 基因工程抗原与合成肽抗原的区别
1.1 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点:
a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸;而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。
b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3-4个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。
c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定
簇，可提高试剂盒的灵敏度，提高检出率。
d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。
1.2 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点:
a.分子量太小
b.一般只含有一个抗原决定簇
c.纯度高
d.稳定性差
由于基因工程抗原较于合成肽抗原有无可比拟的优越性，ELISA诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。就HCV ELISA试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV特异性抗原决定簇的肽片段;第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV的核心区片段;第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多，更稳定，纯度更高的HCV特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。
由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学得对待反应结果。
2.假阳性本底产生的原因
2.1抗原因素
2.1.1 融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断试剂盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列，因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。
2.1.2 错误排序的影响。合成肽在制备过程中，如果某些肽序列错误，会导致合成肽特异性改变而产生假阳性。另外，在构建基因工程表达载体时引入的HCV核苷酸发生相位改变或点突变也会对抗原的特异性产生不利的影响，但由于基因工程技术的不断进步，由工艺原因造成的抗原特异性降低会逐渐被克服。
2.2.3抗原纯度对特异性的影响。以HCV抗原为例，利用大肠杆菌大规模表达后需经破碎细胞，盐析，粒子交换柱等分离纯化步骤才能最后的到一定纯度的HCV抗原。目前的工艺还不能做到抗原纯度为100%，因此抗原中还混有大肠杆菌的其它杂蛋白，受过大肠杆菌感染的人，血清中的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性。
2.2 人血清中的正常IgG
人血清中IgG的浓度对HCV试剂盒有较大的影响。HCV试剂盒采用的间接法，酶标抗
抗体能与人所有IgG结合，而IgG吸附于板孔的能力很强，因此我们采用100微升样稀加10微升血清来将其稀释以降低本底。到成人时，据统计学调查，成人IgG12mg/ml，
而有些人的IgG浓度会远远高于此，这部分人的血清经ELISA反应后往往会显色。
2.3人血情中异常的IgG
结缔组织病(系统性红斑狼疮，多发性骨髓瘤等)等病症时，血清中的风湿小体和其它异常IgG(IgG浓度达到50mg/ml)会引起本底升高或假阳性。
2.4溶血的影响
当溶血时，红细胞中的血红蛋白释放到血清中，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，当其通过吸附或"PP效应"(蛋白质间相互吸附的现象)结合后，可催化A，B液显色而造成假阳性。
2.5操作不当引起
任何操作不当都会影响结果，因此在操作过程中保证操作的规范，严格按照说明书进行是得到准确结果的关键核基础。
2.5.1加样
2.5.1.1 样品稀释液少加，或血清多加，都会引起本底增高。对于间接法来说，受上述两个因素影响更大。因为血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异的IgG均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。如果加入的血清过多，高于规定的稀释倍数，必将带来阴性高值。
2.5.1.2 酶结合物的不正确加入。一般来讲，酶也有一定的非特异吸附，将包被好的酶联板再封闭，一方面也可避免酶的非特异性吸附。通常每孔加入的封闭液为120μl。如果加入的酶多于120μl或加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。
2.5.2温育
5.2.1 由于试剂盒确定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点，升高反应的温度，会加快反应，同样增加时间会延长反应，这样得到的反应程度会比试剂盒确定的反应程度多，也会引起阴性高值或假阳性。
5.2.2由于试剂盒通常设定的反应温度为37度，在这个温度下放置30分钟，蒸发的水分会很多，对于整个反应体系来讲，各种反应物的浓度会不断增加，这样必会导致反应最后的值升高。因此温育时应盖上胶贴。
5.2.3 试剂盒在设计时，反应是在静置条件下完成的，如果反应改变为振动条件，会加快分子的热运动，增加反应的机会。
5.2.4 试剂盒的温育过程是在培养箱中进行，这和水浴的条件不一样。水浴可是酶联板迅速升温，但较难将温度控制在较稳定的温度，往往高于37度，同样会引起高性。
2.5.3 洗板
2.5.3.1 各个厂家使用的洗液配方是不同的，是根据各自试剂的条件配制的，采用不配套的洗液常会得到不正常的反应结果，包括本底过高。本公司的洗液采用独特的洗涤系统不能和其它公司的试剂盒混用。
2.5.3.2 试剂盒中提供的洗液是浓缩的，应该稀释到规定的倍数使用，过多稀释洗液，会影响洗液的效果，而使反应的本底过高。
2.5.3.3 稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水，电导率小于1。2μs。如果水中含有过多的Ca2+，Mg2+，这些离子会占用表面活性剂，影响洗涤效果。
2.5.3.4 洗板时，应每孔加满洗液，如果加入的洗液液量不够，对洗涤的效果影响也是很大的。本公司的酶联板板孔为400μl，比别的厂家的板孔大，因此洗了别公司的板后要及时调整液量，以避免加液量不满。
2.5.3.5 洗板的次数不够孔内多余的抗原(抗体)或酶结合物不能彻底去除，也会因此本底升高。
2.5.3.6 洗板的强度和洗板的浸泡时间是密切相关的。洗板机不同，使用的泵不同，液体加入时的冲力不同。如果加入洗液的冲力不大，也没有设定浸泡时间，同样会使结果的A值偏高。
2.5.3.7 洗板完毕后，要进行拍板，尽量采用质量好的毛巾和吸水纸，使用易掉渣的纸，纸屑会留在板孔中，由于纸屑中含有氧化剂而造成高值阴性。
2.5.4 显色。加A，B液准确，顺序不能颠倒，要及时终止显色。终止后要在3分钟内读数，否则强阳性会变低。
2.5.5 枪头，加样槽或其它来源的污染如果使用的枪头，加样槽是反复使用的，必须肯定其没有来自酶或阳性的污染。酶作为反应的催化剂，及其微量也会很明显影响反应。反复使用的枪头，加样槽清洗不当，也会干扰反应。如将枪头使用84消毒液浸泡而没有冲洗干净，因为84是强氧化剂，加入AB液后就会显色。同样枪头和加样槽不正确清洗，改变加入试剂的PH值，反应的结果也会不正常。常常有人用手纸将加样槽擦干，但是如果使用的手纸容易掉渣，会将纸上的强氧化剂留在槽中而影响反应。
2.5.6 测A值时，微孔条底部不透明，带水滴，有划痕及不规则的表面都可能引起A值的升高。
三 cut off值附近血清的处理
1. cut off值附近的值是客观存在的
cutoff值指经过大量临床调查后自行制定的判断阴阳性的界限。Cut off值附近的值客观存在基于以下原因:大量临床阴性样本A值呈正态分布;这些阴性样本A值是由低到高的连续曲线;cutoff值是这个连续曲线上的截断值。
1.1 正常血清A值的正态分布:
当试剂盒研发完成后，需要进行大量的临床样品的考核。其中阴性血清的A值呈正态分布，大约95%的阴性血清值与平均值相近，而有5%的阴性血清则明显低于或高于平均值，这是cutoff值可根据95%的置信限来确定。若试剂盒的特异性很好，可用98%作为置信限来确定cutoff值。但不论是选择多少的置信限，总存在置信限以外的区域，该区域的部分样品A值会高于cutoff值，从统计上说是无法避免的。
1.2 正常血清A值的连续分布
经过大量的临床调查会发现，正常血清的A值是一条从小到大的连续曲线。在这条连续的曲线上，经过计算选取一点作为cutoff值，这一点之下为阴性，之上为阳性，
因此cutoff值附近的值是必然存在的。
2 怎样对待cutoff值附近的血清
2.1 本公司试剂盒有很好的敏感度和特异性，不提倡设置灰区，坚持按照说明书要求，大于等于cutoff的为阳性。
2.2 某些检验单位有划灰区的习惯，灰区一般是在相应的cutoff以下8%-10%范围内，国家并没有一定的规定，对于一定要设置灰区的单位，本公司建议在我们的cutoff值以下10%为灰区。值得注意的是本公司的HCVcutoff是变化的，所以灰区也应是变化的。
2.3 对于可疑样本可采用多次数检验的方法作为阴阳性判断的依据。如进行5此重复性试验，有3次为阳性，2次为阴性，判断样本为阳性。