细胞培养常见问题及可能原因的建议解决方案

培养基pH值变化迅速

1.培养箱CO2分压设置错误  根据培养基中NaHCO3的浓度增大或降低培养箱CO2的分压，NaHCO3浓度为2.0-3.7g/L时，应相应地使用5%-10%的CO2分压

2.细胞培养瓶瓶盖过紧  将瓶盖旋松1/4圈

3.碳酸氢盐缓存系统缓冲能力不足   加入HEPES缓冲液，使其终浓度为10-25mM

4.培养基中盐含量不正确  CO2平衡环境中使用以Earle平衡盐为基础的培养基，大气条件下使用以Hanks平衡盐为基础的培养基

5.细菌、酵母或真菌污染   将细胞和培养基灭菌处理后丢弃



细胞无法在培养器皿上贴壁生长

1.细胞胰酶消化过度  缩短胰酶消化时间或减少胰酶用量

2.支原体污染  隔离细胞，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃

3.培养基中无附着因子  如果使用的是无血清配方，应确保含有附着因子或者使用经过包被的培养板



悬浮细胞聚集成团

1.存在钙离子和镁离子  用不含钙离子和镁离子的平衡盐溶液清洗细胞，轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液

2.支原体污染  隔离细胞，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃

3.蛋白水解酶消化过度导致细胞裂解、DNA释放  用0.001%DNA酶I处理细胞；用PBS冲洗后再接种到新培养基中



细胞生长缓慢

1.培养基或血清改变  比较不同培养基配方中葡萄糖、氨基酸及其他成分有无差异；通过生长实验比较新老批次血清有无差异；增大细胞初始接种密度；使细胞逐步适应新的培养基

2.必需生长促进成分（如L-谷氨酰胺或生长因子）耗竭、缺乏或分解  去除原培养基，加入新鲜培养基；向培养基中添加生长促进成分（如L-谷氨酰胺）

3.轻度细菌或真菌污染  在不添加抗生素的条件下进行培养，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃

4.时间存储不当  血清应于-5℃至-20℃下储存；培养基应于2℃~8℃下避光储存；尽量减少血清和培养基见光时间

5.细胞初始接种密度低  增大活细胞接种密度

6.细胞衰老、老化  将老化细胞丢弃，取用代数较少的细胞

7.支原体污染  隔离细胞，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃



细胞死亡

1.培养箱中无CO2  监测培养箱中CO2使用速度以便确定及时更换气瓶；经常检测管路连接处是否漏气；不要频繁开启培养箱门

2.培养箱内温度有波动  监测培养箱内温度，及时校正

3.使用抗生素达到毒性浓度  减少抗生素的用量；使用无血清培养基时，抗生素浓度应降低至1/10

4.细胞复苏或冻存时受到损伤  取用新的细胞

5.培养基的渗透压不合适  检查完全培养基的渗透压。大多数哺乳动物细胞可耐受260~350mOsm/kg的渗透压，加入某些试剂和药物后会影响培养基的渗透压；昆虫细胞培养基的渗透压（340~380mOsm/kg）要高于哺乳动物细胞

6.培养基中毒性代谢产物蓄积  去除原培养基，换用新鲜培养基